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为了克隆或表达目的基因，需要先将其插入载体。
最经典的方法是“酶切—酶连法”：①PCR扩增目的基因；②用限制酶分别酶切PCR产物和载体，形成互补末端；③用DNA连接酶连接，得到重组质粒。
酶切、纯化、酶连等步骤只需按照说明书操作就行，但有一步必须自己设计——酶切酶连引物，这也是很多研0同学最容易卡住的第一步。

一. 引物的组成

用于酶切酶连的引物通常由三/四部分组成：5'—酶切保护碱基—限制性酶切位点—功能序列（可选）—基因特异性结合区—3'

01 基因特异性结合区

先看下图，了解PCR全过程。

可以看到，扩增目的片段需一正一反两条引物（黄色标识）。

• 退火阶段：两条引物分别与目标区域两端的模板互补结合

• 延伸阶段：DNA聚合酶从引物3'-OH端起始，沿模板合成新链

因此，酶切酶连引物的3'端需含与模板互补的序列，即基因特异性序列。

需注意，第一期介绍过引物设计原则（点击了解），Tm值50-65℃、GC含量40-60%、3'末端尽量是G/C主要要求的就是基因特异性序列，因为真正参与初始退火的只有它。因此应计算基因特异性序列的Tm值，再根据该温度指导退火温度。

但发卡和引物二聚体等结构风险的排查，则针对整段引物。

大家可能会疑惑：后续循环中，模板已包含完整引物序列，那为何退火温度不根据整条引物的Tm值设置呢？
原因是：常规PCR通常只设一个退火温度，而扩增能否顺利启动，关键在初始循环，此时真正与原始模板结合的只有基因特异性序列。

基因特异性序列的选择要点：

• 优先选CDS区：克隆表达通常扩增CDS区，避开内含子

• 避开重复序列：易降低特异性，尤其避免引物3'端落在此类区域

• 一般不选UTR：UTR不编码蛋白，通常无需扩增

基因特异性序列的具体设计步骤：手把手教你三步搞定引物设计！！

下面也会用snapgene具体实操演示。

02 限制性酶切位点

先看下图，了解酶切和酶连过程。

可以看到，在引物的5'端引入限制性酶切位点，使得PCR产物可以被酶切，经过酶切-酶连就可以获得重组质粒。

• 酶切：用限制酶分别切割PCR产物和载体，两者末端产生匹配的黏性/平末端

• 酶连：DNA连接酶催化磷酸二酯键形成，将目的基因与载体连接成重组质粒

酶切位点的选择要点：

• 载体MCS（多克隆位点）含有多个唯一的酶切位点，可从中选择，避免载体被切成多个片段

• 所选位点不能在目的片段内部，避免目的片段被切断

• 尽量选两种产生不同黏性末端的酶，实现定向插入，减少载体自连

• 若计划同管双酶切，两个位点之间最好间隔＞10 bp，以提高酶切效率；若间距较近，可考虑分步酶切

下表是实验室常用的限制性内切酶。

03 酶切保护碱基

当酶切位点位于DNA末端时，切割效率可能明显下降，因为酶需要一定空间才能稳定结合并切割，否则酶“站都站不稳”，自然就切不动了。

解决很简单：在引物5'端、酶切位点外侧再加上几个碱基，这就是保护碱基。多数内切酶对保护碱基的具体序列没有特殊要求，但应避免形成发夹或引物二聚体，不同内切酶对保护碱基长度要求可能不同，以所用酶的说明书为准。

04 功能序列

如果构建重组质粒是为了表达目的蛋白，那么引物设计就需要考虑添加功能序列。

许多表达载体已提供这类序列，如果载体已提供，引物通常无需重复添加，如果没有，则可根据实验需要由引物补上。

正向引物F可能需要添加：

• 起始密码子（ATG）：蛋白质翻译起始的位置

• Kozak序列（如GCCACCATGG）：用于哺乳动物细胞表达，增强翻译起始效率

• N端短标签：位于N端（MCS上游）的短标签，如His、Flag标签，便于蛋白纯化或检测

• 蛋白酶切位点：便于纯化后切除融合标签

反向引物R可能需要添加：

• 终止密码子（TAA/TAG/TGA）：蛋白质翻译终止的位置，如果不需要载体提供的C端融合标签，则需添加终止密码子

• C端融合标签：位于C端（MCS下游），作用与N端短标签类似，如需载体提供的C端标签，则应保证引物R不含终止密码子，让翻译延伸至载体C端标签

❗无论加入什么功能序列，都要保证目的基因与标签处于同一阅读框，否则可能发生移码，无法表达出所需的目的蛋白或标签，具体步骤将结合SnapGene进行演示。

二. 引物的设计实操

接下来以构建pET-21a(+)-EGFP重组质粒为例，演示如何使用SnapGene设计酶切酶连引物。

首先，从SnapGene官网下载并打开质粒图谱文件：

• 表达载体：pET-21a(+)

• 含目的片段的质粒：pEGFP

先读懂质粒图谱更快设计引物：新手第一次看质粒图谱，如何快速读懂？

01 基因特异性结合区

打开pEGFP质粒，找到EGFP编码序列。

以正向引物F为例：从目的基因5'端开始滑动选择，SnapGene会随选择长度实时显示Tm值和GC含量。

选定一条尽量满足长度18-30、Tm值50-65℃、GC含量40%-60%的引物后，点击【引物】→【添加引物】，选择【顶部链】，点击【添加到引物模板】。

反向引物R同理，从目的基因3'端开始滑动选择，点击【添加引物】时选择【底部链】。

接下来需验证引物特异性，避免与非目标区域结合导致非特异性扩增。点击【工具】→【BLAST选定的引物】，跳转后的步骤见引物干货第二期（点击跳转公众号阅读）

02 限制性酶切位点+酶切保护碱基

按前面提到的酶切位点的选择要点，在pET-21a(+)载体的MCS区域中选择酶切位点，逐一排查这些位点是否存在于EGFP内部，可从实验室已有的常用酶入手。

以HindIII为例：复制HindIII序列，打开pEGFP质粒，点击底部【查找】→【查找DNA序列】，粘贴序列后回车。结果显示HindIII在EGFP 内部不存在，可选为酶切位点。

用同样方法选定第二个位点（如BamHI）。

选好两个位点后，接下来的问题是：哪个加在引物F上，哪个加在引物R上？规则是：引物F添加MCS上游的酶切位点，引物R添加MCS下游的酶切位点。

那么如何判断哪个是上游、哪个是下游？看载体的转录方向：启动子箭头的方向即转录方向。本例pET-21a(+)中，转录方向为从右向左，因此BamHI位于MCS上游，HindIII位于MCS下游。

最后，根据所选酶说明书添加保护碱基，如说明书无特殊要求，可使用Snapgene随机添加4-6个碱基。

引物F具体操作步骤：点击添加的引物，选择插入的【酶切位点】并打勾【添加×上游碱基】，点击插入。

引物R其余设置不变，但插入【酶切位点】时需勾选【反向互补序列】。

03 功能序列

功能序列设计的核心，是根据载体已有元件决定去留。载体有的，引物不再重复加；载体没有但实验需要的，就通过引物补上。

以pET-21a(+)为例，载体自带N端T7 Tag和C端6×His标签。若需融合表达，引物应不含起始或终止密码子，保证翻译通读。若不需要C端His标签，引物R应含终止密码子可提前终止翻译。

引物模拟验证

通过在SnapGene中模拟整个酶切-连接过程，可确认引物设计是否正确。接下来仍以构建pET-21a(+)-EGFP重组质粒为例。

01 模拟PCR→目的基因PCR产物

打开pEGFP质粒，点击【行动】→【聚合酶链式反应（PCR）】，输入或选择已添加的引物F/R，输入PCR产物名称，点击【聚合酶链式反应（PCR）】进行模拟。

拿到PCR产物后检查：

• 产物总长度=目的基因长度+3'/5'端附加序列（保护碱基+酶切位点+功能序列（可选））

• 酶切位点：确认酶切位点（BamHI&HindIII）是否存在且正确

点击【工具】可选择【模拟琼脂糖凝胶】进一步模拟电泳结果。

02 模拟酶切&酶连→重组质粒

Snapgene同时模拟酶切和酶连两个过程的。

打开pET-21a(+)质粒，点击【行动】→【限制和插入片段克隆】→【插入片段】。

• 模拟酶切载体（pET-21a(+)）：点击【载体】，选择酶切位点，选择要替换的区域

• 模拟酶切目的基因PCR产物（EGFP）：点击【片段】，导入刚刚模拟的PCR产物图谱，选择酶切位点，选择要插入的片段

输入重组质粒名称，点击【克隆】进行模拟。

拿到重组质粒后检查：

• 重组质粒长度=载体长度+目的片段长度+功能序列长度（可选）

• 插入方向：插入片段的箭头方向是否与载体启动子箭头方向一致

• 阅读框：若用于蛋白表达，需确认目的基因与上下游元件（起始密码子、标签、终止密码子）衔接正确，不出现移码或提前终止。

03 检查阅读框

阅读框的检查，主要通过观察质粒图谱中标注的氨基酸序列，判断目的基因与上下游元件是否衔接一致。

若衔接正确，图谱上会显示一条连续的氨基酸序列。

若出现两条错位序列，则说明阅读框已错位，可通过增/减引物中酶切位点与基因特异性序列之间的碱基数来校正。

如需使用载体C端标签，还需额外确认两点：①目的基因内部不能有终止密码子，否则C端标签无法被翻译（如下图）。

②C端标签自身的阅读框也必须与上游序列衔接一致，才能被正确翻译，否则标签也无法正常表达。

上述步骤完成后，即可将最终确认的引物序列交付新一产合成。

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