高通量测序文库制备解决方案

高通量基因测序是一种革命性的DNA或RNA测序技术，通过建库、测序和数据分析几个步骤能够在相对较短的时间内、同时测序多个DNA或RNA分子，从而实现对基因组、转录组、表观基因组等的全面分析。相比传统的Sanger测序技术，高通量测序具有更高通量、更快速度和更低成本的优势。因此，越来越多的科研工作者采用高通量测序技术作为课题研究的主要手段。

在高通量测序过程中，基因文库的质量直接影响后续的测序工作，因此构建基因文库是整个测序过程中最为关键的步骤。文库构建的常规基本步骤有： DNA的片段化、末端补平加A 、测序接头连接、PCR扩增和纯化。在上述涉及的相关实验过程中，酶在其中起着至关重要的作用。本文将介绍在文库构建过程中使用到的关键原料酶、酶制剂、试剂盒及新一产可提供的相关服务。

图1.文库制备流程

文库构建的第一步是对DNA样本进行片段化处理，以获得片段大小合适的DNA分子。DNA片段化的方法主要分为酶法打断和超声波打断。酶法打断通常是用限制性内切酶特异性识别并切割磷酸与脱氧核糖之间的化学键，通过控制酶切时间和酶量，可一次性处理多个样本，但存在偏好性，且对样本的质量要求较高；也可通过转座酶来打断基因组DNA，转座酶具有双重活性，能够在将基因组DNA片段化时,同时在片段两端添加特定的接头，将片段化、末端修复和接头连接等步骤合而为一，有效减少样品处理时间。

图2.DNA片段化

双链DNA的随机片段化可产生多种末端，如3´／5´-末端突出，3´-末端多磷酸基团／5´-末端缺磷酸基团，常见的末端类型为黏性末端和平末端。

图3.常见末端类型

T4 多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase, T4 PNK）是来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，它可催化ATP的γ位磷酸转移至双链或单链DNA、RNA的5'端羟基，也可将3´-磷酸基团从寡核苷酸的3´磷酸末端上水解掉，用于DNA或RNA 5´末端的磷酸化、除去3´磷酸基团，以便进行连接反应；DNA或RNA的末端标记，用作探针和进行DNA测序。

许多连接酶对A残基具有亲和力，为提高连接效率通常会给DNA末端添加腺嘌呤（A）残基，可选择Klenow Fragment (3´→5´exo–)。

末端带A尾的DNA片段和末端带T尾的接头，在T4 DNA连接酶的作用下连接在一起的过程称为接头连接。接头本质是一段短的碱基序列，作为桥梁连接待测DNA片段与测序仪的芯片，并为文库打上标签。除了在DNA片段的两端连上接头序列以外，部分实验还会为不同的样本添加上独特的标签以给样品添加索引，用于多样本同时测序。

图4.接头连接

添加接头后的文库体系中含有多种杂质及酶类、接头等残留，由于末端的不稳定性也会自连产生大片段，需经由特殊磁珠纯化来去除，从而获得成功添加接头的文库片段。

在文库制备中，需要通过PCR扩增对文库进行富集。在扩增步骤不引入突变对高质量测序结果至关重要。普通的Taq聚合酶由于缺乏校对活性，不适合用于高通量测序文库富集，而高保真酶由于具有3'→5′核酸外切酶活性，是用于高通量测序文库扩增的理想选择。经过接头连接步骤后，两端连接有接头的DNA片段将附着在流动槽上并进行测序。

高通量测序实验中，投入测序运行的文库分子过多或过少，都会使数据质量受损。测序文库的定量分析和质量评价对于获得高质量的核酸测序数据十分关键。所以在PCR富集之后，通常会验证文库中DNA的数量和纯度，对文库进行准确量化，以量化插入片段的数量和大小分布，确定要加载到测序仪上或用于后续反应（如外显子组富集）的文库数量。

常用的文库定量方法有紫外分光光度法、荧光染料法以及实时荧光定量PCR法。

新一产依托强大的高通量底层核心技术，结合自身生物学、蛋白工程、核酸化学三大业务平台，提供高通量测序过程中多品类、定制化、贯穿全流程的原料；同时也可根据客户需求，提供文库构建的关键产品和整体解决方案，提供更加便于使用的产品形式。