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高通量测序技术可大规模解析DNA序列信息，广泛用于基因组、遗传变异及功能研究。常见策略包括全基因组测序、外显子测序和靶向测序。

全基因组测序虽全面，但会产生大量与研究目标无关的数据，成本较高。外显子测序聚焦编码区，减少了非编码冗余，但仍不能精准关注目标区域。

靶向测序为将测序资源集中于目标区域，在测序前选择性富集目标序列，提高目标区域在测序数据中的比例，从而以更低成本获得更高测序深度。

全基因组测序、外显子测序和靶向测序示意图；DOI：10.1016/j.csbj.2019.10.004

杂交捕获是常用的靶向富集策略，流程如下：

• 文库准备：将基因组DNA片段化并连接测序接头，构建待捕获文库

• 探针杂交：生物素标记的捕获探针与目标DNA片段互补杂交，形成探针-靶标复合物

• 磁珠捕获与洗涤：链霉亲和素磁珠捕获复合物，洗涤去除未稳定结合的非目标片段。

• 扩增与测序：富集文库经扩增后测序，使数据集中覆盖目标区域

捕获探针是杂交捕获成功的关键，其设计需综合考虑覆盖度、特异性、均一性和捕获效率等因素。本文围绕这些目标，系统介绍杂交捕获探针设计的关键原则。

一、特异性：优先识别预期靶标

探针高效结合目标序列的同时，应与非靶序列的亲和力尽可能低。难点在于：基因组中存在大量相同或高度相似的序列，包括重复元件、复制性区域、假基因、旁系同源基因及高度保守的基因家族成员。当探针识别多个基因组位置时，各匹配区域均可能被富集，导致脱靶捕获。

那么，如何确保特异性？

（一）重复序列掩蔽

重复序列指基因组中多次出现、序列高度相似的DNA片段。若基于此类区域设计探针，探针可能与多个位点杂交，降低捕获特异性。因此，设计前需用RepeatMasker等工具识别并掩蔽重复序列。

RepeatMasker识别并掩蔽重复序列（蓝色标记）；DOI:10.1186/1471-2105-9-253

Kenny等人设计CDC42和PTBP2捕获Panel时发现，严格的重复序列掩蔽使可设计区域仅约40%。放宽掩蔽限制（选择性掩蔽）使可设计比例提升至54%和77%，但最终上靶率仅约21%。

不同掩蔽策略下的探针覆盖对比；DOI：10.1093/dnares/dsq029

（二）基因组唯一性评估

假基因（失去功能的基因副本）和旁系同源基因（同一物种内因复制产生的序列相似基因）虽不属于经典重复元件，但其序列与靶标高度相似，同样可导致探针交叉杂交。杂交强度取决于序列相似性、GC组成和二级结构等多种因素。

因此，候选探针还需通过BLAST等工具进行全基因组比对，剔除具有多个高相似性匹配位点的探针，确保其特异性。

二、探针长度：常见选择为120 nt

探针长度影响杂交稳定性、错配容忍度及合成质量。

• 杂交稳定性：探针更长提供更大的相互作用区域，杂交更稳健

• 错配容忍度：实际样本序列常与参考基因组存在差异。探针越长，互补碱基总数越多，少量错配仍可依靠其余匹配区域维持稳定杂交，因而对序列变异容忍度更高

• 合成与结构：寡核苷酸越长合成难度和成本更高，且更易形成不利的二级结构

目前120 nt为多数商业化平台常用长度。与早期170 nt相比，120 nt探针合成可靠性更高，配合叠瓦均一性更优。但这并非普适标准，可根据样本质量调整，比如高度降解的样本适合更短的探针。

三、叠瓦：为目标覆盖提供冗余保障

当目标区域长度超过单条探针可覆盖范围时，需沿靶区连续设计多条部分重叠的探针，即叠瓦（tiling）设计。其核心参数为叠瓦密度，即每个碱基平均被探针覆盖的次数。

捕获探针沿目标区域叠瓦式排列；DOI：10.1186/gb-2009-10-10-r116

（一）叠瓦的作用

探针的捕获效率受GC含量、二级结构或序列变异等因素影响，表现不一。若某条探针捕获效率低，可能导致局部覆盖不足。叠瓦式设计通过引入重叠探针提供冗余捕获，可有效弥补不足，保证目标区域的覆盖可靠性。

若探针B捕获效率低，重叠探针A/C可补偿捕获

（二）差异化叠瓦策略

更高的叠瓦密度导致探针数量增加（合成成本上升）和探针间竞争加剧。因此实践中常采用差异化叠瓦策略：对关键区域（如核心外显子、已知致病位点）给予更高密度（如3×）；对一般区域采用常规密度；对高度降解的样本，采用3×-5×以提高捕获概率。

不同叠瓦密度对目标区域覆盖效果的影响；DOI：10.1186/gb-2009-10-10-r116

Jiménez-Mena等人在三个物种的捕获Panel设计中，对已知SNP等优先区域采用3×叠瓦，随机区域仅用单条探针，在有限探针数量下兼顾关键区域覆盖与更广泛的基因组采样。

不同目标区域采用差异化探针设计策略；DOI：10.1111/1755-0998.13598

四、序列组成与热力学性质

（一）GC含量

GC含量约45%时捕获效率最高，低于23%或高于66%时覆盖率显著下降。不同研究阈值略有差异（如40%–55%或40%–60%），但核心原则一致——避免极端GC，缩小Panel内探针的GC分布宽度，以维持各探针热力学行为的一致性，保证覆盖均一性。

探针GC含量与捕获效率的关系；DOI：10.1186/gb-2009-10-10-r116

（二）熔解温度均一性

熔解温度（Tm）反映探针-靶标双链的热稳定性。捕获反应中，所有探针共用同一杂交温度。若Tm分布过散，则部分探针无法处于最优状态，损害覆盖均一性。因此，应尽量使Panel内Tm分布相对集中。

（三）二级结构

探针自身可能形成发夹结构等二级结构，使部分碱基无法参与靶标杂交。靶标DNA的局部二级结构也可能降低探针可及性。此类分析可通过mfold、UNAFold等热力学折叠软件进行预测。

二级结构预测图；https://www.unafold.org/www-NAR03/supp/node8.html

五、应对序列变异

探针通常基于参考基因组设计，但真实样本可能存在SNP（单碱基变异）或Indel（插入缺失）。若这些变异落在探针结合区，便会使探针与模板错配。长探针对SNP容忍度较高，但Indel的影响更大，仍可能严重降低捕获效率。

若已有群体变异数据（如dbSNP、gnomAD），可将高频变异位点作为探针设计的避让依据，或在关键区域增加叠瓦密度，以形成冗余覆盖。

需注意：探针设计需在Panel层面而非单条探针层面进行考量。单条探针性能优异，不代表整合后Panel整体表现良好。若探针间存在互补区域，可能形成探针-探针杂交，降低有效探针浓度，影响捕获效率。此类风险需借助MrBait等计算工具进行序列聚类分析和规避。

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