技术文章

一、mRNA展示，到底是什么？

肽链翻译产生后，通常可以评估其结合或功能表现，却难以仅从肽本身直接回推出其编码序列。为解决这一难题，mRNA应运而生。

mRNA展示借助puromycin（嘌呤霉素），在翻译过程中将新生肽链与其编码mRNA共价连接。这样，一旦后续筛到目标肽链，可直接通过相连的mRNA，对其进行逆转录、PCR扩增和测序，从而读出其序列。

💡puromycin如何连接肽链和mRNA？ 

如下图，图A：正常的酪氨酰-tRNA，图B：puromycin，其结构模拟了氨酰-tRNA的3'端关键部分，因此能被核糖体识别并参与接肽反应。

粉色标出了puromycin的关键差异结构。其中，连接氨基酸与核糖的键由天然氨酰-tRNA中的酯键变为酰胺键，因此更稳定、不易水解。

详细过程如下：

体外翻译开始后，核糖体沿mRNA正常延伸新生肽链。mRNA的3'端已预先连接DNA-PEG-puromycin linker。

DNA-PEG-puromycin linker：DNA部分用于连接mRNA，PEG部分提供柔性与长度，使puromycin能伸入核糖体。

经典mRNA展示中，RNA/DNA连接处即可促使核糖体停顿；在某些改良体系中，通过在ORF末端引入UAG终止密码子，当核糖体读取至此时，因体外翻译体系缺失释放因子1，核糖体将进一步停滞，为后续融合反应创造条件。

核糖体停滞时，A 位点可供puromycin进入

Puromycin模拟氨酰-tRNA进入停滞核糖体的A位点，利用肽基转移酶活性，其α-NH₂与新生肽链共价结合，形成“肽链–puromycin–mRNA”融合体。

核糖体本应将肽链转到下一个tRNA，但puromycin冒充tRNA进入A位点，将肽链“骗”到了自己身上

融合体从核糖体释放后，由于肽链与其编码mRNA共价连接，可先通过靶点筛选富集功能性肽段，再通过测序其连接的mRNA来鉴定序列。

Puromycin缺乏完整tRNA骨架，虽能接受肽链但无法继续延伸，使得融合体从核糖体释放

二、mRNA展示具体流程

（一）设计并构建DNA文库

一个用于mRNA展示的DNA模板通常包含：5' promoter（体外转录）、5' UTR（适配翻译）、起始密码子、开放阅读框（ORF）、3' UTR（用于RT-PCR）。此外，还可加入固定区、随机区、标签或功能模块。

❗注意事项：

（1）更应“受控随机化”，而非盲目“全随机化”

mRNA展示常见文库规模可达10^12–10^14（部分可达10^15），但序列空间随肽链长度指数增长（20^n），10^15仅能完整覆盖约11–12个氨基酸。因此强调“受控随机化”——围绕

功能位点、结合界面或环肽窗口进行约束设计，而非无差别全随机化。

（2）固定区的设置应随文库类型而变化

固定区指文库中不参与随机化的恒定序列部分，可用于维持结构/功能骨架，并支撑后续扩增与测序；其具体设置应随文库类型和应用目标而变化。

（二）体外转录并连接puromycin

构建好的DNA文库经体外转录生成mRNA，随后将带有puromycin的linker连接到mRNA的3'端。

❗注意事项：

（1）linker长度并非越长越好

当linker长度超过约30 nt时，融合形成效率反而下降；相较于单纯延长 linker，引入PEG spacer（如Spacer 9）提升柔性，更有利于提高融合形成效率。

（2）不同linker连接方式各有取舍

• splint ligation：成熟常用，但需要额外纯化去除DNA splint，以避免RNase H介导的mRNA降解

• photo-cross linking：连接快、可减少纯化步骤，但需警惕UV对核酸的潜在损伤

• Y-ligation：避免splint残留，便于拓展cDNA display，但linker设计复杂

• TRAP display：流程更快，但依赖非共价连接稳定性，需足够长的互补序列来保证

（三）体外翻译，形成mRNA–肽融合体

具体过程已在上文叙述。

❗注意事项：

（1）注意翻译“错读”导致的基因型—表型脱钩

在遗传密码重编程或引入非天然氨基酸时，测序结果未必完全对应实际翻译产物；当某些非天然氨基酸利用效率较低时，还可能出现翻译停滞和异常产物。为避免误判，

建议在正式筛选前对关键密码子—氨基酸组合进行预验证，并在命中序列确认时结合质谱分析。

（2）翻译体系的选择应与文库目标同步设计

mRNA展示所用的体外翻译体系应与文库类型相匹配。普通线性肽文库通常可采用常规体系；而涉及非天然氨基酸、宏环肽或遗传密码重编程时，

则更适合选用组分可精确调控的重组体外翻译体系（如PURE/FIT）。

（四）逆转录（mRNA→cDNA）

筛选前通常将mRNA–肽融合体逆转录为cDNA/mRNA双链。

❗注意事项：

（1）为什么很多体系先逆转录再筛选？

反转录后形成mRNA/cDNA双链，不仅是为了提高稳定性，还可减少RNA二级结构带来的干扰，并降低无意中筛出RNA适配体的风险。

（2）逆转录后，核酸干扰仍需警惕

对于转录因子等核酸结合蛋白，融合体上的mRNA/cDNA标签仍可能通过电荷吸附或核酸识别界面参与结合，造成假阳性或富集偏倚。

因此，这类靶标在mRNA展示中通常需要设置更严格的反筛、空白对照和非特异竞争核酸，并在筛后对去标签肽进行独立验证。

（五）与靶标孵育并洗涤筛选

完成融合体制备后，文库与靶标蛋白或目标体系孵育。最常见的方式是将靶标固定在磁珠或固相载体上，通过结合与洗涤步骤富集功能分子：与靶标结合的融合体被保留，未结合或弱结合者则被洗去。

❗注意事项：

（1）反筛不可或缺

反筛是指在正式筛选前，先将文库与磁珠、载体、标签蛋白或基质等非目标组分孵育，以提前剔除易非特异性吸附的序列。mRNA展示的假阳性不仅来自肽段对靶标的

非特异性黏附，也可能源于对磁珠、标签、基质乃至核酸标签本身的吸附。

（2）根据不同需求调整筛选条件

• 缩短孵育、降低靶标浓度利于富集快结合（高kₐ）分子，增强洗涤则倾向保留慢解离（低kₐ）分子

• 洗涤过苛会丢失中等亲和力乃至优质序列，首轮超高多样性文库（>10¹²）尤需谨慎，建议系统性对比不同洗涤强度（如1次与3次），而非默认越严越好。

• 洗涤过轻则非特异结合残留，后续应结合高通量测序看富集趋势，不宜仅凭单轮回收量判断。

（六）回收、扩增，并进入下一轮

结合到靶标上的融合体洗脱后，回收其对应核酸并进行PCR扩增，得到富集后的dsDNA文库。该文库可继续进入下一轮“转录—翻译—筛选”循环，也可在合适轮次进行测序分析。

❗注意事项：

（1）PCR扩增既是优势也是偏倚来源

mRNA展示每轮均可直接PCR扩增，并便于引入易错PCR或DNA洗牌等策略进行定向进化。但富集结果受PCR偏好、序列丰度、翻译表达及连接体形成效率等影响，

NGS读数高未必亲和力最强。因此，应结合多轮富集趋势、阴性对照及独立亲和力验证综合评判候选序列的真实质量。

（2）富集轮数并非越多越好

mRNA展示多采用3–10轮连续富集。传统琼脂糖体系常需6–10轮，而微流控CFMS可压缩至3–4轮。轮数本质在于去除背景、提升信号，不应视为硬性指标。

（七）测序并验证

经过数轮富集后，对回收文库进行测序，即可识别候选序列；随后还需要对命中肽做单独合成/表达，并通过结合、活性、稳定性等实验进行验证。

三、研究者青睐mRNA展示的原因

研究者青睐mRNA展示，通常不是因为它“概念新”，而是因为它在几个关键维度上确实很强。

（一）文库规模大

相比依赖宿主转化效率的噬菌体展示、酵母展示等体系，mRNA展示通过体外转录翻译可构建的文库通常可达10¹²–10¹⁴量级，这意味着它更有能力覆盖更大的序列空间，也更适合寻找低概率出现的高性能分子。

（二）筛选条件灵活

由于mRNA–肽之间是共价连接，体系本身又不依赖细胞存活，因此研究者可以更自由地调节盐浓度、pH、温度、洗涤强度，甚至设计一些对细胞体系并不友好的筛选条件。这一点对于酶工程、稳定性筛选、极端条件筛选尤其有价值。

（三）更适合做化学空间扩展

mRNA展示尤其适合与非天然氨基酸引入、宏环化、后修饰等策略结合，从而不只是筛“天然肽”，而是筛一类更接近药物化分子的候选物。正因如此，它在宏环肽、PPI抑制肽以及难成药靶点配体发现中表现非常突出。

（四）更有利于识别真实亲和力差异

mRNA展示通常以单价形式呈现分子，不像噬菌体展示那样可能因多价展示产生avidity效应。因此，在筛选过程中，研究者更容易区分中等亲和力与高亲和力分子，而不易受到“多拷贝展示导致表观结合增强”的干扰。

❗但mRNA展示并不是“万能筛选法”。

首先，许多mRNA展示实验依赖纯化靶标和固相筛选。这意味着，如果靶标的天然构象高度依赖膜环境、复合物状态或复杂翻译后修饰，那么固载在磁珠或板面上的靶标未必能够完全代表其真实生物学状态，尤其对于构象敏感型靶点，更需谨慎。

其次，假阳性来源也不容忽视。例如，带强正电的目标蛋白可能与带负电的mRNA标签发生非特异性相互作用，某些核酸结合蛋白也可能受到mRNA标签的干扰。因此，合理设置阴性筛选、反筛和竞争洗脱，都是实验设计中的关键。

最后，常规mRNA展示并不天然适用于所有依赖复杂真核翻译后修饰的蛋白。

四、mRNA展示典型应用方向

（一）宏环肽与类天然产物样肽分子发现

案例来源：Ribosomal synthesis and de novo discovery of bioactive foldamer peptides containing cyclic beta-amino acids. 

为什么选择mRNA展示：希望筛选的并不是普通线性肽，而是含非天然氨基酸、具备环化结构的宏环肽分子。mRNA展示与FITsystem和 RaPID system结合后，可在超大规模文库中同时实现遗传密码重编程与宏环化设计，因此特别适合发现更接近天然产物风格的候选分子。

⭐FIT（Flexible In Vitro Translation）是可重编程的体外翻译体系；RaPID（Random nonstandard Peptides Integrated Discovery）则进一步将FIT与mRNA展示整合，用于含非天然氨基酸的宏环肽文库构建与高亲和力配体筛选。

文库设计：该研究采用基于简并密码子构建的从头宏环肽文库，随机区由6–15个简并密码子组成，并结合遗传密码重编程引入环状β-氨基酸、通过自发环化形成硫醚大环。