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文库峰形异常、有效reads偏低、PCR重复率过高、表达结果不稳定……高通量测序数据不好，问题可能早已埋在建库流程中。

本文将从常见问题出发，按照建库流程逐步拆解：

有哪些可能出现的问题？可能的原因？如何提前预防降低风险发生几率？

一、核酸提取：守住样本质量

核酸提取可分为DNA提取和RNA提取。

DNA-seq、WGS、靶向捕获、宏基因组等多以DNA为模板；

RNA-seq、转录组和表达分析则以RNA为模板。

由于RNA更易降解、受RNase污染，本文将以RNA提取为例，拆解该阶段的常见风险与优化思路。

（一）优品推荐

综上可知，RNase污染是导致RNA降解、实验失败的最常见且最隐蔽的原因之一。即使严格遵守无RNase操作规范，样本或试剂中残留的微量RNase（如RNase A、B、C）仍可能在提取、纯化或逆转录过程中降解RNA。

为此，我们推荐使用新一产RNase Inhibitor（#LS-EZ-E-00006），从源头保护RNA完整性。

（二）实验数据展示

将300 ng RNA底物与100 pg RNase A及不同品牌RNase Inhibitor于37 ℃共孵育1 h，测定RNA剩余量。结果显示，加入新一产RNase Inhibitor（#LS-EZ-E-00006）后，可有效降低RNase A对RNA的降解影响，帮助维持RNA样本完整性。

💡补充说明：RNA类样本通常需先经逆转录获得cDNA，再进入后续文库构建流程。

二、核酸片段化：决定文库片段分布

多数高通量测序平台的读长有限，而待测核酸分子往往较长，因此通常需片段化至合适长度。

（一）优品推荐

针对上述问题，我们推荐两款高性能产品，您可根据样本投入量、通量需求和实验偏好选择。

（二）实验数据展示：Transposase

采用相同的实验流程，使用两个不同批次（09R18、09N19）的转座酶分别进行3次重复。结果显示，新一产转座酶构建的文库均一性高，主带集中分布在200-400 bp，批次间重复性良好。

三、末修&加A：统一片段末端状态

片段化后的DNA末端状态往往不统一（突出端或5'端缺少磷酸基团），影响接头连接效率。

末修&加A主要包括5'端磷酸化、末端修复和3'端加A，用于统一片段末端状态，提高接头连接效率与文库构建均一性。

（一）优品推荐

针对上述问题，我们提供四款核心酶，您可根据实验需求灵活组合或单独使用。

（二）实验数据展示：T4 DNA聚合酶

四、接头连接：决定“有效文库”数量

接头连接将含有已知序列的adapter接到DNA片段两端，使片段具备PCR扩增、平台识别和上机测序的能力。接头还可提供测序引物结合位点，并支持Index引入，实现多样本混合测序。因此，连接效率决定有效文库分子的得率和数据利用率。

（一）优品推荐

新一产T4 DNA连接酶可催化双链DNA或RNA的平末端或粘性末端相邻的5'磷酸与3'羟基形成磷酸二酯键，是NGS文库构建中插入片段与adapter连接的核心催化酶。

（二）实验数据展示

⭐至此，我们已经完成从核酸提取、片段化、末修&加A到接头连接的关键风险拆解。

但高质量文库的形成并未止步于此——后续的PCR富集、环化&成球、上机准备，同样深刻影响着文库复杂度、有效数据占比与最终测序质量。

下一期，我们将继续沿着建库流程，拆解这些后续步骤中的常见操作风险、数据影响与优化思路，敬请期待！