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高通量测序建库系列（下）：风险全拆解（附产品解决方案）
发布时间：2026-05-29
上篇（点击回顾）梳理了高通量测序实验中从核酸提取到接头连接的关键要点。本篇将继续沿着实验流程，聚焦PCR富集、环化&成球、上机测序三大关键步骤，进一步拆解常见风险、排查思路与相关产品解决方案。
一、PCR富集：获得足量有效文库
接头连接后，DNA片段两端已带有扩增和测序所需的接头。PCR富集的作用是扩增这些成功连接接头的片段，使文库量满足后续质控、混样、环化或上机测序的要求。
需注意，PCR富集既决定文库产量，也影响文库代表性：循环数过多或扩增体系不当会引入偏倚、升高重复率，进而损害测序数据质量。因此，其核心是在获得足量文库的同时，尽可能保持原始样本中序列的真实比例，为环化、成球和上机测序提供高质量文库基础。
（一）优品推荐
在PCR富集阶段，聚合酶体系直接关系到扩增保真度、产量和序列偏倚控制。
为此，我们推荐使用新一产Mars HiFi PCR ReadyMix (#LS-EZ-K-00004) ，是文库PCR富集的高保真扩增选择。
（二）实验数据展示
以人基因组DNA为模板，对不同GC含量的基因片段进行扩增，结果表明，我司的Mars HiFi高保真预混液对各种GC含量（27%-85%）的基因片段均能很好扩增，具有良好的兼容性，且扩增能力及扩增特异性优于其他同类产品。
二、环化&成球：转化可上机模板
对于采用DNB策略的平台，PCR产物并不能直接完成测序：带有兼容adapter的文库需经变性、splint辅助环化形成单链环状文库（ssCir），再通过消化去除未环化的线性分子，随后以环状模板进行滚环扩增（RCA），生成DNA纳米球（DNB），最终加载到规则阵列芯片上完成测序。
这一环节的核心逻辑可以概括为：环得上、清得净、成得足。任一环节不足，都可能造成可加载DNB减少或后续有效数据受损。
（一）优品推荐
未环化的线性单链或双链分子不仅不能正常转化为目标DNB，还可能消耗反应资源、增加背景并影响后续质量。因此，环化后的消化步骤应覆盖不同类型的线性残留，同时尽量保留目标环状模板。
为此，我们推荐使用新一产Exonuclease I与Exonuclease III，清除环化后的线性残留。
Exonuclease I与Exonuclease III分别针对环化后残留的线性单链DNA与双链DNA，联合使用可降低线性残留背景。
（二）实验数据展示
将我司核酸外切酶I与核酸外切酶III联合使用，用于消化BGISEQ-500 DNA建库环化后残留的未环化底物。结果显示，两种酶联用可有效减少未环化底物残留。
三、上机测序：守住最终数据质量
DNB制备完成后，需要先进行定量，再加载到测序芯片上。芯片表面排列着大量固定位置，每个位点可承载一个DNB。测序过程中，仪器逐轮读取各个位点的碱基荧光信号，并将其转换为最终的序列数据。
因此，DNB浓度是否合适、加载操作是否准确、测序试剂与仪器状态是否正常，都会影响最终获得的有效数据量和测序质量。
（一）优品推荐
在测序反应体系中，PPi累积及单链DNA局部二级结构可能影响聚合酶相关反应表现。
为此，我们推荐使用新一产Pyrophosphatase（#LS-EZ-E-00017）与Tth SSB单链结合蛋白（#LS-EZ-E-00003），为测序反应体系开发与优化提供原料支持。
（二）实验数据展示
在E320文库与NA12878标准文库的Make DNB测试中，本品DNB Yield、Q30及ESR均高于对照竞品。
*说明：该数据展示的是Pyrophosphatase在成球反应（Make DNB）中的应用表现，本品亦可应用于上机测序反应体系。
❗高通量测序的稳定输出依赖全链条质控：前端减少文库损失与扩增偏倚，中段提高环状模板与DNB转化效率，后端保证加载与测序质量。提前识别风险、逐步核对关键指标，才能获得稳定、可重复、可解释的结果。
围绕高通量测序实验流程，新一产提供覆盖关键环节的全链条产品与解决方案支持，助力文库构建更稳定、实验结果更可靠。
如您有高通量测序相关实验需求，欢迎联系我们，获取产品信息与技术支持。
